WWW.NEW.Z-PDF.RU
БИБЛИОТЕКА  БЕСПЛАТНЫХ  МАТЕРИАЛОВ - Онлайн ресурсы
 

«ДЕТЕКЦИИ ДИФТЕРИЙНОГО ТОКСИНА © 2009 г. Н. А. Бызова*#, В. В. Свиридов2*, Н. Ф. Гаврилова2*, Е. Н. Распопова2*, И. В. Яковлева2*, А. Н. Генералова3*, Ю. В. Лукин3*, ...»

УДК 543.645 : 616.931

ИММУНОХРОМАТОГРАФИЧЕСКАЯ И ЛАТЕКС-АГГЛЮТИНАЦИОННАЯ СИСТЕМЫ

ДЕТЕКЦИИ ДИФТЕРИЙНОГО ТОКСИНА

© 2009 г. Н. А. Бызова*#, В. В. Свиридов2*, Н. Ф. Гаврилова2*, Е. Н. Распопова2*,

И. В. Яковлева2*, А. Н. Генералова3*, Ю. В. Лукин3*, В. В. Черкасова4*, А. В. Жердев*,

Б. Б. Дзантиев*

*Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН, 119071, Москва, Ленинский просп., 33;

*НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН, Москва;

*Институт биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва;

*Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского, Москва Поступила в редакцию 13.10.2008 г. Принята к печати 26.11.2008 г .

С использованием двух моноклональных антител, специфичных к разным эпитопам дифтерийного токсина, разработаны системы ускоренного выявления токсигенности коринебактерий дифтерии, основанные на иммунохроматографической и латекс-агглютинационной детекции дифтерийного токсина. Методы апробированы на выборке из 36 клинических изолятов. Показана возможность достоверного выявления токсигенных свойств штаммов Corynebacterium после подращивания изолятов в течение 1 сут. Разработанные методы позволяют определять дифтерийный токсин в концентрациях до 3–4 нг/мл. Разработанные тест-системы благодаря существенному сокращению времени по сравнению с традиционными микробиологическими методами являются перспективными средствами диагностики дифтерии .

Ключевые слова: дифтерийный токсин; иммунохроматографический анализ; реакция латексагглютинации .

ВВЕДЕНИЕ Дифтерийная токсикоинфекция остается смертельно опасным заболеванием, и своевременная оценка токсигенных свойств возбудителей, изолированных от больных и общавшихся с больными лиц, необходима для правильного выбора терапевтических и противоэпидемических мероприятий [1]. Дифтерийный токсин (ДТ, белок М 62 кДа) является основным фактором патогенности возбудителя, ответственным за развитие тяжелых осложнений, таких, как поражение миокарда, полиневропатии, токсическое поражение печени и др. [2]. Для выявления ДТ в массовой клинико-диагностической практике, как правило, применяется реакция иммунодиффузии в агаре. С учетом времени, необходимого для взятия мазка, посева, выделения чистой культуры, постановки реакции и формирования преципитатов токсина с антисывороткой, заключение о токсигенности возбудителя получают на третьи–четвертые сутки. Для Сокращения: ББ – 0.1 М боратный буфер, рН 8.2; ДАТ – дифтерийный анатоксин; ДТ – дифтерийный токсин; ИХА – иммунохроматографический анализ; МА – моноклональные антитела; МЦТ – микроцитотоксичность; РЛА – реакция латекс-агглютинации; ФБС – 50 мМ К-фосфатный буфер, рН 7.4, с 0.1 М NaCl; ФБСТ – ФБС с 0.05% Твина-20; Lf – единица флоккуляции .

# Автор для связи (тел.: (495) 9544009; факс: (495) 9542804; эл. почта: nbyzova@inbi.ras.ru) .

совершенствования диагностики было предложено ускоренное и существенно более чувствительное выявление ДТ методом твердофазного ИФА в жидкой среде подращивания возбудителя [3]. Применяя моноклональные антитела к ДТ, можно даже без выделения чистой культуры через сутки после взятия мазка выявлять токсин в концентрации до 0.001 единиц флоккуляции (Lf) на 1 мл [4, 5], что в десятки раз ниже порога детекции иммунодиффузионных тестов. Однако твердофазный ИФА также не вполне удобен для массового применения, поскольку его проведение требует специального приборного оснащения .

В настоящее время для детекции различных соединений активно используются экспрессные иммунохимические тесты с длительностью до 10 мин, сочетающие высокую чувствительность с простотой постановки, возможностью быстрого получения ответа при бесприборной (визуальной) регистрации результатов [6–9]. Несомненный интерес представляет детекция ДТ с помощью иммунохроматографического анализа (ИХА) и реакции латекс-агглютинации (РЛА) .

На сегодняшний день диагностика дифтерии с помощью данных форматов анализа рассматривалась лишь в единичных работах [10, 11]. Проведенные исследования ограничивались демонстрацией принципиальной реализуемости одного из методов и его пригодности для тестирования биопроб. Для формирования доказательной основы перехода к экспрессным иммунохимическим тестам целесообразно, используя одни и те же иммунореагенты, реализовать различные методы иммунодетекции ДТ и сопоставить их при анализе одной и той же выборки образцов .

С учетом имеющейся реагентной базы – ранее полученных и описанных в работах [4, 5] моноклональных антител (МА) против ДТ – задачей настоящего исследования являлась разработка на основе этих антител методов иммунохроматографического и латексагглютинационного выявления дифтерийного токсина и их сравнение с традиционным микропланшетным ИФА .

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В работе были использованы антитела МА ДТ-17 и МА ДТ-22, способность которых нейтрализовать действие ДТ была показана в микроцитотоксическом тесте (МЦТ) на культуре чувствительных к токсину клеток СНО [12, 13] .

Для анализа взаимного расположения антигенных детерминант, распознаваемых антителами двух клонов, в соответствии с предложенным в работе [14] подходом были сопоставлены концентрационные зависимости связывания индивидуальных клонов и их эквимолярной смеси (рис. 1). Прирост сигнала в смеси антител по сравнению с зависимостями для индивидуальных клонов свидетельствует о взаимодействии антител с разными детерминантами ДТ .

С использованием МА ДТ-17 и МА ДТ-22 разработана иммунохроматографическая система детекции ДТ. Данный вид анализа основан на движении элюента вдоль мембраны под действием капиллярных сил, которое приводит к образованию на участках мембраны с иммобилизованными иммунореагентами визуализуемых иммунных комплексов. Благодаря специфичности антител к разным детерминантам ДТ возможен двухсайтный сандвич-иммуноанализ, как правило, более чувствительный по сравнению с другими форматами .

Выбор нагрузки МА на коллоидных частицах проводили, согласно рекомендациям [15, 16], предусматривающим анализ оптического поглощения растворов коллоида при 580 нм в присутствии сорбируемого белка в разных концентрациях. На рис. 2 представлены полученные концентрационные зависимости. Как видим, добавление антител вначале приводит к росту оптического поглощения, после чего величина А580 резко уменьшается и выходит на плато .

Концентрация МА, соответствующая стабилизации А580, рассматривается как обеспечивающая насыщение центров иммобилизации. В качестве оптимальной принимается концентрация МА, на 10–15% превосходящая точку выхода на плато [15, 16]. Для МА ДТ-17 была выбрана концентрация 23, а для МА ДТ-22 – 15 мкг/мл .

Для получения в ходе ИХА четких, хорошо визуализуемых зон была определена оптимальная комплектация тест-систем. Для формирования контрольной зоны использовали кроличьи (RAMIss, два препарата), козьи (GAMIss, три препарата) и овечьи (SAMIss, два препарата) антитела против иммуноглобулинов мыши производства фирмы «Имтек». Были выбраны овечьи антитела SAMIss 1, так как они обеспечивали максимальное связывание коллоидных конъюгатов (рис. 3). Для формирования аналитической зоны использовали МА против ДТ .

Были изготовлены иммунохроматографические тест-полоски двух видов: в первом варианте на мембране иммобилизовали МА ДТ-17, а с коллоидным золотом конъюгировали МА ДТ-22; во втором на мембрану наносили МА ДТ-22, конъюгируя с золотом МА ДТ-17. При оптимизации протоколов анализа применяли дифтерийный анатоксин (ДАТ) ввиду его большей стабильности и безопасности манипуляций. Окончательную характеристику тест-систем проводили с использованием ДТ. Первый вариант тест-полосок позволяет выявлять ДАТ в концентрациях от 30 нг/мл (рис. 4а, в); с помощью второго варианта ДАТ определяется в концентрациях от 4 нг/мл (рис. 4б, в). Максимальная интенсивность окраски аналитической зоны для второго варианта тестполосок в 1.5 раза больше, чем для первого. Таким образом, предпочтительным является второй вариант. Предложенная система ИХА позволяет детектировать ДАТ и ДТ в течение 10 мин в концентрациях, соответствующих требованиям медицинской диагностики .

Вторым реализованным видом экспрессного анализа была реакция латекс-агглютинации .

Исходя из соображений стабильности конъюгатов, был выбран вариант прямой латексагглютинации, в котором используются латексные частицы с иммобилизованными на их поверхности антителами. Синтезированные монодисперсные полиакролеиновые частицы имели средний диаметр 1.65 мкм и концентрацию альдегидных групп 30 мкмоль на 1 г .

Разработка системы РЛА была начата с выбора концентрации МА для иммобилизации на поверхности латексных частиц [17]. О сорбции МА судили по агглютинации диагностикума кроличьей антисывороткой к IgG мыши. Показано, что оптимальная концентрация МА равна 2 мкг/мл, а ее превышение приводит к спонтанной агглютинации. Диагностикумы на основе МА ДТ-17 или МА ДТ-22 агглютинировались кроличьей сывороткой против IgG мыши, но практически не давали отклик при добавлении ДАТ. Отсутствие агглютинации с ДАТ можно объяснить специфичностью антител к уникальным, неповторяющимся детерминантам антигена, не позволяющей сформировать агрегат латексных частиц. Поэтому было решено иммобилизовать на латексных частицах антитела к разным эпитопам ДТ, одновременно добавляя в равных количествах МА ДТ-17 и ДТ-22. Полученный диагностикум активно агглютинировался ДАТ и ДТ, но не взаимодействовал с препаратом Кодивак из клеточной стенки нетоксигенного штамма другими бактериальными токсинами и Corynebacterium diphtheriae, (ботулиническим столбнячным анатоксинами) и компонентами микробиологических сред, что отражает его специфичность, сохраняя активность в течение 1 года (срок наблюдения) при 4С .

РЛА можно использовать не только как качественный, но и как полуколичественный метод, характеризуя пробы по предельному разведению, дающему положительную реакцию. Предел выявления ДТ и ДАТ методом РЛА составил 3–6 нг/мл. Ранее было показано [4, 5], что ИФА на основе этих же антител характеризуется порогом детекции ДАТ около 3, а ДТ – 1 нг/мл .

Разработанные методы ИХА и РЛА были применены для ускоренной детекции ДТ в среде подращивания коринебактерий. Для этого использовали 36 клинических изолятов. Все изоляты предварительно тестировали в реакции иммунопреципитации на способность к токсинообразованию. Из 36 изолятов 32 относятся к виду C. diphtheriae. Из них 23 изолята относятся к биовару gravis и, по результатам иммунопреципитации, продуцируют ДТ (tox+). Два изолята определены как биовар gravis, но не продуцируют токсин (tox–), 5 – биовар mitis, tox+, 2 – биовар intermedius, tox–. 4 изолята относятся к виду C. ulcerans, 3 из них по данным иммунопреципитации синтезируют дифтериеподобный токсин (di tox+), 1 изолят – не синтезирует (di tox–) .

После подращивания изоляты тестировали методами иммунопреципитации, ИФА, РЛА и ИХА. Как видно из табл. 1, наблюдалась хорошая корреляция данных, полученных разными методами, что свидетельствует о возможности использования разработанных методов как эффективной альтернативы традиционным. Существенные различия наблюдались только для изолятов С. ulcerans № 20–22. Тестирование среды подращивания этих изолятов методами РЛА и ИХА не привело к выявлению токсина. Особенностью изолятов № 20–22 являлось также то, что наблюдаемые в ИФА титры были получены при низком значении оптической плотности (0.1–0.3) .

Для прояснения ситуации изоляты № 7, 19–22, 27, представляющие разные виды и биовары коринебактерий, в ходе их доращивания – от 24 до 72 ч – были охарактеризованы методами РЛА, ИФА и МЦТ-теста. Полное совпадение результатов (см. табл. 2) наблюдалось только для МЦТ и РЛА. Это позволяет полагать, что, несмотря на сходство токсинов C. diphtheriae и С. ulcerans (их аминокислотный состав совпадает на 95% [18, 19]), МА ДТ-17 и ДТ-22 выявляют отличия в их структуре, существенно влияющие на связывание как с МА, так и с клеточными рецепторами ДТ .

Отметим, что в предложенных диагностикумах использованы протективные МА, специфичные к С-концевому участку ДТ. Это позволяет детектировать лишь молекулы токсина, способные к связыванию с мембранным рецептором токсина [20] и проявлению цитотоксичности. Чем обусловлены иммунохимические отличия токсинов, вырабатываемых разными изолятами С .

ulcerans, предстоит исследовать в дальнейшем .

В целом, полученные характеристики и результаты апробации разработанных методов свидетельствуют о возможности с их помощью быстро выявлять дифтерийный токсин с высокой чувствительностью, повышая эффективность диагностики дифтерии .

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Реактивы. Дифтерийный токсин, выделенный из среды культивирования C. diphtheriae, штамм PW-8 и очищенный до удельной активности 1.000 Lf на 1 мг белка, был любезно предоставлен В.Д. Смирновым (НПО «Микроген», филиал «Иммунопрепарат», Уфа). В работе использовался препарат дифтерийного анатоксина НПО «Биомед», Пермь с активностью 170 Lf на 1 мг белка, а также препараты ДАТ НПО «Микроген», филиал «Иммунопрепарат», Уфа, и ОАО «Биомед» им. И.И. Мечникова, Москва .

При оценке специфичности аналитических методов применяли вакцину Кодивак (ГУП по производству бактерийных препаратов им. Г.Н. Габричевского, Москва), образцы столбнячного и ботулинических (типа А, В и Е) анатоксинов (НПО «Микроген», филиал «Иммунопрепарат», Уфа) .

В работе использовали козьи (GAMIss), кроличьи (RAMIss) и овечьи (SAMIss) антитела против иммуноглобулинов мыши производства ООО «Имтек» (Россия), Тритон Х-100, Твин-20, дигидрохлорид, азид натрия США), краситель 3,3,5,5-тетраметилбензидина (Sigma, кристаллический фиолетовый (Serva, Германия), золотохлористо-водородную кислоту –(Fluka, Германия), кроличью антисыворотку к IgG мыши, бычий сывороточный альбумин –(ICN Biomedicals, Великобритания), персульфат калия (Reanal, Венгрия) .

Акролеин (Fluka, Германия) трижды перегоняли при атмосферном давлении и использовали фракцию, кипящую при 56С, 420 0.806 г/см3, nD20 1.4013 .

Все соли были аналитической или химической чистоты. Воду для приготовления растворов очищали на установке MilliQ (Millipore, США) .

Отбор и подращивание проб. Использованные в работе штаммы Corynebacterium выделяли от больных и бактерионосителей, высевали на бульон Лингуда (ОАО «Биомед» им. И.И .

Мечникова, Петрово-Дальнее) с добавлением 10% сыворотки плода коровы и выращивали при 37С в течение 24 или 48 ч. Затем центрифугированием при 2000 g в течение 15 мин осаждали бактерии и отбирали надосадок для проведения анализов .

МА к дифтерийному токсину получали и характеризовали в соответствии с работами [4, 5, 12]. После гибридизации иммунных спленоцитов мышей BALB/c с клетками миеломной линии P3-X63-Ag.8.653 пролиферирующие культуры – продуценты антител – подвергали двукратному клонированию. МА, наработанные в среде культивирования и в асцитах, осаждали сульфатом аммония (50%-ное насыщение) и аффинно очищали на ДАТ, конъюгированном с BrCN-сефарозой (LKB, Швеция). Оценивали связывание МА с антигеном в ИФА и их способность нейтрализовать действие ДТ в дермонекротическом тесте на морских свинках и в культуре чувствительных к ДТ клеток (см. ниже). Концентрацию МА определяли спектрофотометрически, используя формулу [белок, мкг/мл] = 144(A215–A225) [21] .

Получение коллоидного золота с размером частиц 30 нм. К 97.5 мл воды добавляли 1.0 мл 1% раствора золотохлористо-водородной кислоты. Смесь доводили до кипения и при перемешивании добавляли 1.5 мл 1% раствора цитрата натрия. Кипятили 30 мин, затем охлаждали до комнатной температуры. Полученный препарат хранили при 4оС .

Определение концентрации МА, оптимальной для иммобилизации на частицах коллоидного золота. К 0.1 мл водного раствора МА в концентрациях от 5 до 250 мкг/мл добавляли по 1.0 мл раствора коллоидного золота (A520 1.0), перемешивали и инкубировали 10 мин при комнатной температуре. Затем в каждую пробу добавляли 0.1 мл 10% NaCl и перемешивали .

Через 10 мин измеряли A580 .

Иммобилизация МА на частицах коллоидного золота. МА диализовали против 1000кратного объема 10 мМ карбонатного буфера, рН 9.0. К коллоидному золоту (A520 1.0) добавляли

0.1 М К2СО3 до достижения рН 9.0, а затем – МА. Смесь инкубировали 10 мин при комнатной температуре и перемешивании, после чего добавляли 10% раствор БСА до конечной концентрации 0.25% .

Частицы коллоидного золота отделяли от неиммобилизовавшегося белка 30-минутным центрифугированием при 8000 g, ресуспендируя осадок в 50 мМ К-фосфатном буфере, рН 7.4, с

0.1 М NaCl (ФБС), содержащем 0.25% БСА. При необходимости длительного хранения добавляли NaN3 до конечной концентрации 0.05% .

Для формирования иммунохроматографической системы использовали набор mdi Easypack фирмы «Advanced Microdevices» (Индия), включающий рабочую мембрану CNPC-SN12 L2-P25 (размер пор 15 мкм), подложку под конъюгат PT-R5, мембрану для нанесения образца FR1(0.6), адсорбирующую мембрану GFB-R4 и ламинирующую защитную пленку МТ-1 .

Нанесение реагентов на иммунохроматографические мембраны. Конъюгаты коллоидного золота с МА наносили на 1 см полосы в объеме 8 мкл в разведениях, соответствующих A520 2.0, с помощью диспенсера IsoFlow фирмы «Imagene Technology» (США) .

Для формирования аналитической зоны использовали МА против ДТ, контрольной зоны – овечьи антитела против иммуноглобулинов мыши SAMIss 2 прозводства &[ (Россия). На 1 см полосы наносили 2 мкл антител (0.5 мг/мл в ФБС, содержащем 10% глицерина) [22] .

Иммунохроматографический анализ проводили при комнатной температуре. Тест-полоску погружали на 1.5–2 мин в анализируемую пробу в вертикальном положении, затем извлекали, помещали на горизонтальную поверхность и через 10 мин визуально контролировали результат ИХА. Количественно связывание коллоида в контрольной и аналитической зонах регистрировали путем сканирования мембран на сканере Be&Paw 4800TA pro (Mustek, Тайвань) и компьютерной обработки видеоцифровых данных [23, 24] .

Полиакролеиновые суспензии (латексы) получали полимеризацией акролеина в воднощелочной среде в две стадии [25]. На первой стадии (анионная осадительная полимеризация) в воду, содержащую краситель кристаллический фиолетовый, добавляли свежеперегнанный акролеин в соотношении мономер–вода, 1 : 20 (по объему), а потом по каплям при перемешивании

0.2 M NaOH до достижения рН 10. Реакционную смесь инкубировали 3 ч при комнатной температуре и перемешивании. Вторую стадию (радикальная полимеризация) инициировали добавлением персульфата калия (2% по массе в расчете на мономер) и проводили 2-часовую инкубацию при 70С и перемешивании в атмосфере азота. За ходом полимеризации следили гравиметрически, согласно работе [26]. Выход полимера составлял около 40% .

Иммобилизация МА на латексных частицах. К 50 мкл 10%-ной латексной суспензии добавляли от 10 до 100 мкл МА с концентрацией 1 мг/мл, доводили объем до 0.5 мл и инкубировали ч при комнатной температуре и перемешивании. Для блокировки непрореагировавших групп добавляли 4 мл 1% раствора овальбумина в 0.1 М боратном буфере, рН 8.2 (ББ). От несвязавшихся МА латексные частицы отмывали в ББ трехкратным 10-минутным центрифугированием при 1200 g. Осадок ресуспендировали в 5 мл ББ с 1%-ным овальбумином и хранили при 4С .

Реакция латекс-агглютинации. Разведения испытуемых препаратов с шагом 2 готовили в объеме 25 мкл в 96-луночном круглодонном микропланшете производства ПО «Ленмедполимер»

в ББ с 1%-ным овальбумином. В качестве контроля использовали ББ. После добавления во все лунки по 25 мкл латексного диагностикума микропланшет встряхивали и инкубировали 1 ч при 37С. Интенсивность агглютинации оценивали по четырехбальной системе: +++, ++, +, – .

Твердофазный ИФА. В лунки микропланшетов Nunc maxisorb (Nunc, Дания) вносили по 100 мкл МА ДТ-17 с концентрацией 2 мкг/мл в ФБС и инкубировали 1 ч при 37С. Планшет трехкратно отмывали ФБС с 0.05% Твина-20 (ФБСТ). Далее в лунки вносили по 100 мкл надосадков среды подращивания в разведении 1 : 10, титровали с шагом 2 и инкубировали 1 ч при 37С. Затем микропланшет отмывали, вносили пероксидазный конъюгат поликлональных противодифтерийных лошадиных антител, выделенных на аффинном сорбенте ДАТ-Сефароза [4, 5], и инкубировали 1 ч при 37С. Планшет повторно отмывали и определяли пероксидазную активность как указано ниже .

Характеристика взаимного расположения детерминант ДАТ, распознаваемых антителами ДТ-17 и ДТ-22. Сорбцию ДАТ в лунках микропланшетов осуществляли в течение ночи при 4С из 100 мкл раствора с концентрацией 0.2 мкг/мл в ФБС. Микропланшет четырехкратно отмывали ФБСТ, после чего в лунки вносили по 100 мкл МА ДТ-17, ДТ-22 и их эквимолярной смеси в ФБСТ (диапазон концентраций – от 0.4 до 400 нг/мл) и инкубировали 1 ч при 37С. Затем микропланшет повторно отмывали, добавляли 100 мкл антивидового иммунопероксидазного конъюгата (ООО «Медгамал», разведение 1 : 6000 в ФБСТ) и инкубировали 1 ч при 37С. После отмывки микропланшета определяли пероксидазную активность как указано ниже .

Определение активности пероксидазы. Использовали два субстрата: о-фенилендиамин (0.4 мг/мл) в 30 мМ цитратно-фосфатном буфере (рН 4.4) с 2 мМ Н2О2 и 3,3',5,5'-тетраметилбензидин (0.4 мМ) в 40 мМ Na-цитратном буфере, рН 5.5, с 3 мМ Н2О2. В лунки микропланшета вносили по 100 мкл субстрата, инкубировали 15 мин в темноте при комнатной температуре, останавливали реакцию добавлением 50 мкл 1 М H2SO4 и измеряли А490 (о-фенилендиамин) или А450 (3,3',5,5'тетраметилбензидин) .

Тест на микроцитотоксичность (МЦТ). Образцы коринебактерий подращивали на бульоне Лингуда и отделяли стерильные надосадки как описано выше. Полученные пробы титровали в 96луночных культуральных планшетах (Nunc, Дания) с шагом 2 в объеме 50 мкл среды RPMI 1640 (Sigma, США) с 10% сыворотки плода коровы. Затем в каждую лунку вносили по 104 клеток СНО (Chinese hamster ovary cells) в 100 мкл среды RPMI 1640 с 10% СПК. Планшеты помещали на 72 ч при 37С в СО2-инкубатор (5% СО2). Выраженность цитотоксического эффекта учитывали с помощью инвертированного микроскопа. Положительным контролем служили лунки, содержавшие 50 мкл среды Лингуда и 4 минимальные цитотоксические дозы ДТ (оттитрованного на культуре клеток СНО), отрицательным – лунки с 50 мкл среды Лингуда .

–  –  –

Рис. 3. Взаимодействие в иммунохроматографической системе различных иммобилизованных антивидовых антител с МА против ДТ, конъюгированными с коллоидным золотом.

Антитела:

RAMIss 1 (1), RAMIss 2 (2), GAMIss 1 (3), GAMIss 2 (4), GAMIss 3 (5), SAMIss 1 (6), SAMIss 2 (7). Черные столбцы соответствуют МА ДТ-17, заштрихованные столбцы – МА ДТ-22 .

(а) (б)

–  –  –

Рис. 4. Зависимость интенсивности окраски аналитической зоны от концентрации ДАТ для двух вариантов иммунохроматографических систем: а – в аналитической зоне сорбированы МА ДТ-17, с коллоидным золотом конъюгированы МА ДТ-22; б – в аналитической зоне сорбированы МА ДТс коллоидным золотом конъюгированы МА ДТ-17; в – концентрационные зависимости интенсивности окраски аналитической зоны для вариантов а (кривая 1) и б (кривая 2) иммунохроматографических систем .

–  –  –

72 – – – 72 – 1 : 160 – 72 – 1 : 160 – 24 – 1:5 –

Похожие работы:

«ЕЖЕКВАРТАЛЬНЫЙ ОТЧЕТ Акционерное общество Минерально-химическая компания ЕвроХим Код эмитента: 31153-H за 4 квартал 2014 г. Место нахождения эмитента: 115054 Россия, Москва, ул. Дубининская, 53 стр. 6 Информация, с...»

«ГОДОВОЙ ОТЧЕТ 2011 СОДЕРЖАНИЕ СОДЕРЖАНИЕ 1 ВВЕДЕНИЕ 1.1 Требования к отчету 1.2 Общий обзор содержания отчета 2 О КОМПАНИИ 2.1 Обзор производства 3 СОБЛЮДЕНИЕ НОРМ ОЗТПБ И ПРИРОДООХРАННЫХ МЕРОПРИЯТИЙ 3.1 Системы управления охраной здоровья, труда, промышленной безопасностью и п...»

«Мисуркин Павел Игоревич ФЛИККЕР-ШУМОВАЯ СПЕКТРОСКОПИЯ В ПАРАМЕТРИЗАЦИИ СТРУКТУРЫ ПОВЕРХНОСТИ ТВЁРДОФАЗНЫХ СИСТЕМ В НАНОМЕТРОВОМ ДИАПАЗОНЕ НА ОСНОВЕ ДАННЫХ АТОМНО-СИЛОВОЙ МИКРОСКОПИИ Специальность 01.04.07 – физика конденсированного состояния АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата...»

«Урок 18. Такт. Размеры 2/4 и 4/4 Сегодня мы займёмся. почти математикой. Не удивляйся, Президент Пианино, музыка и математика очень похожи. Даже слова начинаются с одной буквы "м". Какую ты знаешь самую маленькую единицу длины? Родители подскажут — миллиметр. Какую ты знаешь самую маленькую единицу веса? Грамм. Самый маленький отр...»

«ГЕОФИЗИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ И БИОСФЕРА, 2011, T. 10, № 1, с. 5–8 УДК 550.34 ВЫДАЮЩЕЕСЯ ДОСТИЖЕНИЕ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК: УСПЕШНЫЙ ПРОГНОЗ ЗЕМЛЕТРЯСЕНИЯ В ЯПОНИИ 11 МАРТА 2011 г. © 2011 г. А.Я. Сидорин Институт физики Земли им. О.Ю. Шмидта РАН, г. Москва, Ро...»

«Методическое руководство Использование пара перекиси водорода для дезинфекции Введение В 1994 г. компания Drger представила первый электрохимический сенсор на перекись водорода (H2O2) для контроля низких концентраций паров перекиси водорода (ППВ). Пары перекиси во...»

«Министерство образования и науки Российской Федерации Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования ПЕТРОЗАВОДСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ К. А. Кулаков, В. М. Димитров ТЕХНОЛОГИИ XML ЧАСТЬ...»

«ОБЧИСЛЮВАЛЬНІ СИСТЕМИ УДК 681.3 В.А. ЯЩЕНКО* ОТ МНОГОМЕРНЫХ РЕЦЕПТОРНО-ЭФФЕКТОРНЫХ НЕЙРОПОДОБНЫХ РАСТУЩИХ СЕТЕЙ К ЭЛЕКТРОННОМУ МОЗГУ РОБОТОВ * Институт проблем математических машин и систем НАН Украины, Киев, Украина Анотація. У статті розглядається концепція розро...»

















 
2018 www.new.z-pdf.ru - «Библиотека бесплатных материалов - онлайн ресурсы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 2-3 рабочих дней удалим его.