WWW.NEW.Z-PDF.RU
БИБЛИОТЕКА  БЕСПЛАТНЫХ  МАТЕРИАЛОВ - Онлайн ресурсы
 

«БПК-БИОСЕНСОР НА ОСНОВЕ ДРОЖЖЕЙ DEBARYOMYCES HANSENII, ИНКАПСУЛИРОВАННЫХ В КРЕМНИЙОРГАНИЧЕСКИЕ ЗОЛЬ-ГЕЛЬ МАТРИЦЫ Е.Л. Афонина, Д.Г. Лаврова, ...»

Химические науки

УДК: 543.9:663

БПК-БИОСЕНСОР НА ОСНОВЕ ДРОЖЖЕЙ

DEBARYOMYCES HANSENII, ИНКАПСУЛИРОВАННЫХ

В КРЕМНИЙОРГАНИЧЕСКИЕ

ЗОЛЬ-ГЕЛЬ МАТРИЦЫ

Е.Л. Афонина, Д.Г. Лаврова, К.С. Щукина, О.А. Каманина

Синтезированы органосиликатные материалы на основе тетраэтоксисилана

(ТЭОС), метилтриэтоксисилана (МТЭС) и полиэтиленгликоль (ПЭГ) с молекулярной массой 3000 Да. Применение силановых прекурсоров ТЭОС и МТЭС в соотношении 15/85 и ПЭГ 3000 в условиях основного катализа позволили провести иммобилизацию дрожжей Debaryоmyces hansenii ВКМ Y-2482 в кремнийорганическую золь-гель матрицу. Ранее было показано, что в данных условиях вокруг каждой клетки формируются капсулы и органосиликатная капсула защищает клетки от воздействия вредных факторов. Полученный биораспознающий элемент был использован при разработке БПКбиосенсора. Значения БПК, определяемые с помощью биосенсора на основе инкапсулированных дрожжей и стандартным методом, незначимо отличаются между собой .

Разработанный биосенсор является перспективным инструментом для мониторинга загрязнений сточных вод .

Ключевые слова: БПК-биосенсор, биохимическое потребление кислорода, зольгель, инкапсулированные дрожжи, гибридный биоматериал .

Введение В современном мире огромное количество выбросов приходится на водный бассейн. В водоемы сбрасываются не только бытовые и производственные стоки, но также стоки с пищевых и биотехнологических производств, которые, с химической точки зрения не являются опасными, однако способствуют нарушению природного баланса и тем самым приводят к эвтрофикации водного объекта .



Одним из критериев загрязненности воды органическими веществами является количество кислорода, потребляемого в ходе аэробного окисления этих веществ микроорганизмами за определенный интервал времени – биохимическое потребление кислорода (БПК), выражаемое в миллиграммах на литр .

Общепринятая методика определения БПК требует инкубирования насыщенной кислородом пробы в течение 5 (БПК5) или 20 суток (БПКполн). Отсутствие оперативности существенно снижает ценность такого определения. По указанной причине могут возникать экологически опасные ситуации, при которых остается "за кадром" поступление в водоемы загрязненных вод или их недоочистка в процессе регенерации, и выброс неочищенных стоков. Это диктует необходимость использования экспресс-методов контроля БПК. Метод оценки БПК, основанный на использовании биосенсорных анализаторов, позволяет сократить время с нескольких суток до нескольких минут, что важно для оперативного Известия ТулГУ. Естественные науки. 2016. Вып. 4 анализа. В настоящее время разработано большое количество лабораторных моделей и коммерчески производимых БПК-анализаторов, информация о которых суммирована в последних обзорах [2, 3] .

Анализ результатов исследований по разработке БПК-биосенсоров позволяет заключить, что наиболее достоверные коррелирующие со стандартным методом данные по БПК удается получить на основе биосенсоров с использованием целых клеток микроорганизмов. Важным моментом в развитии БПК-биосенсоров является увеличение времени жизни и устойчивости к различным токсическим веществам микроорганизмов, закрепленных на поверхности преобразователя сенсора [4]. Описанные проблемы могут быть решены с помощью инкапсулирования микроорганизмов в различные матрицы .





Силикатные материалы являются перспективными для иммобилизации живых клеток, поскольку являются естественной средой обитания для многих микроорганизмов. Кроме того, в природе существует целая группа организмов, которые для создания своих скелетов и защитных оболочек используют кремнезем. Клетки диатомовых водорослей снаружи окружены твердой кремниевой оболочкой, называемой панцирем, который обеспечивает клеткам механическую защиту [5]. Важнейшая функция таких систем — защита жизненных функций организмов и генетического материала своего вида от неблагоприятных условий, при этом силикатная оболочка не препятствует поступлению питательных веществ в клетку. Материалы на основе кремнезема имеют преимущества перед полимерными материалами, которые часто используют для иммобилизации клеток, именно, способность удерживать воду без значительного набухания, химическая и биологическая инертность, механическая прочность, контролируемая пористость, оптическая прозрачность [6]. Ещё одним преимуществом является методы получения таких материалов из кремнийорганических соединений (прекурсоров) в мягких условиях золь-гель синтеза. Это важно для сохранения физиологической активности микроорганизмов. Золь-гель методы являются экономичными и экологически чистыми. Использование матриц на основе модифицированных силикагелей для иммобилизации целых клеток является относительно новым направлением исследований в биотехнологии, в том числе для получения инкапсулированных клеток, так называемых «искусственных спор» [7]. Инкапсулированные микроорганизмы представляют значительный интерес для разработки эффективных биокатализаторов [8,9], в том числе при создании биосенсоров [10]. Ранее нами было показано, что в условиях основного катализа при определенном соотношении силановых прекурсоров ТЭОС и МТЭС, в присутствии структурообразующего агента ПЭГ и при участии дрожжей Pichia angusta BKM Y-2559 и Cryptococcus curvatus ВКМ Y-3288

Химические науки

происходит самопроизвольное формирование органосиликатной капсулы вокруг клеток [11] .

Важным фактором при разработке БПК–биосенсора является способность микроорганизмов окислять широкий спектр соединений .

Дрожжи Debaryomyces hansenii ВКМ Y-2482 (D. hansenii) обладают широкой субстратной специфичностью, и способны легко окислять различные соединения [3]. В предыдущих исследованиях нами было показано, что БПК-биосенсор на основе кислородного электрода и D .

hansenii характеризуется высокой долговременной стабильностью и чувствительностью [12, 13]. Эти дрожжи являются перспективными биокатализаторами в БПК-биосенсорах благодаря их гало-, осмо- и криотолерантности, что обеспечивает стабильность функционирования микробного биосенсора в присутствии стрессовых факторов среды [14, 15] .

Ранее нашим научным коллективом было показано, что при иммобилизации дрожжевых клеток в золь-гель матрицы на основе силановых прекурсоров ТЭОС, МТЭС и порообразователя ПЭГ 3000, с содержанием гидрофобной добавки МТЭС 85% об .

(от общего объема силановых компонентов матрицы) происходит образование структуры, в которой вокруг каждой клетки формируется капсула, при этом инкапсулированные клетки образуют единую структуру [11]. Известно, что прочные силикатные оболочки, образующиеся вокруг клеток, эффективно защищают их от воздействия механического сдвига, осмотического давления и теплоты [16]. Нами в работе [11] показано, что органосиликатная капсула защищает инкапсулированные дрожжевые клетки от УФ-излучения, от присутствия в растворе ионов тяжелых металлов и повышенной кислотности среды. Поскольку БПК определяют в загрязненных стоках, которые могут содержать токсичные для микроорганизмов примеси, то использование инкапсулированных в зольгель матрицы клеток D. hansenii позволит получить БПК-биосенсор, который способен функционировать стабильно в этих средах .

Материалы и методы В работе использовали метилотрофные бактерии Ogataea polymorpha ВКМ Y-2559 (ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН) .

Иммобилизация биоматериала и формирование биораспознающего элемента. К 0,1 см 20 % раствора полиэтиленгликоля 3000 (ПЭГ) («Ferak Berlin», Германия) в фосфатном буферном растворе прибавляли 0,25 см3 суспензии клеток ((1,3±0,1)·109 КОЕ/см3) в фосфатном буферном растворе (20 ммоль/дм3, рН 7,6) и перемешивали в течение 5 минут (Elmi CM-70M07, Польша), добавляли 0,5 см3 смеси тетраэтоксисилана (ТЭОС) («Sigma», США) и метилтриэтоксисилана (МТЭС) («Sigma», США) и вновь перемешивали в течение 5 минут. Затем добавляли 0,025 см3 0,2 моль/дм3 раствора катализатора NaF,

Известия ТулГУ. Естественные науки. 2016. Вып. 4

перемешивали 15 минут. Дыхательную активность иммобилизованных клеток оценивали с помощью биосенсорной установки .

Биосенсорные измерения. Для проведения исследования использовали модифицированный микробный электрод и анализатора pHметр-иономер-БПК-термооксиметр Эксперт-001-4.0.1 (ООО «Экониксэксперт», Россия), который позволяет регистрировать содержание растворенного кислорода в кювете. В кювету объемом 5 мл помещают буферный раствор и анализируемую пробу .

Для измерений использовали натрий-калиевый фосфатный буферный раствор (рН = 6,8), концентрация солей в котором составляла 20 мМ. Раствор перемешивали магнитной мешалкой (200 об/мин). Пробы вводили автоматическими микропипетками переменного объема (200 – 1000 мкл, 20 – 200 мкл, 0,5 – 10 мкл, Biotech, США). В качестве модельной использовали смесь глюкозы и глутаминовой кислоты в массовом соотношении 1:1 (ГГС), которую применяют как стандарт в определении БПК5 в Российской Федерации и международной практике [19, 20]. В соответствии с нормативной документацией [19] принимали, что БПК5, равное 205 мг/л, соответствует раствору, содержащему 150 мг/л глюкозы и 150 мг/л глутаминовой кислоты (БПК5 = 0,68Сггс) .

Определение БПК5 стандартным методом разбавления. В качестве референтного метода для определения БПК5 использовали метод разбавления. Анализ проводили в соответствии с методикой, указанной в [19, 20]. Определение содержания растворенного кислорода проводили с использованием БПК-термооксиметра Эксперт-001-4.0.1 (ООО «Экониксэксперт», Россия) .

Результаты и их обсуждение Согласно рекомендациям подразделения Международного союза теоретической и прикладной химии (IUPAC) по физической и аналитической химии [21] важными характеристиками биосенсоров являются характеристики: чувствительность, рабочий или линейный интервал концентраций, предел обнаружения и нижняя граница определяемых концентраций .

Время функционирования биосенсора без замены биораспознающего элемента (долговременная стабильность) позволило судить о стабильности биокатализатора на основе инкапсулированных в кремнийорганическую матрицу микроорганизмов. В ходе работы был получен рецепторный элемент с инкапсулированными органосиликатные золь-гель матрицы клеток D. hansenii и определены основные характеристики разработанных рецепторных элементов: субстратная специфичность чувствительность, диапазон определяемых концентраций, операционная и долговременная стабильность .

Важным при разработке БПК–биосенсора является, способность клеток окислять широкий спектр соединений. Профиль субстратной специфичности биораспознающего элемента представлен на рис. 1 .

Химические науки  

–  –  –

Из рис. 1 видно, что инкапсулированные дрожжи окисляют не только спирты, сахара, аминокислоты и органические кислоты, но и способны метаболизировать ароматические и поверхностно-активные соединения, которые содержатся как в промышленных, так и в хозяйственных стоках, что представляет интерес при разработке БПК – биосенсора .

Аналитические и метрологические характеристики БПК-биосенсора определяли на основе измерения изменения дыхательной активности закрепленных на поверхности кислородного электрода инкапсулированых клеток. Содержание кислорода в приэлектродном пространстве изменялось в зависимости от содержания ГГС. Пересчет на БПК осуществляли по формуле БПК=0,68СГГС. Данная зависимость аппроксимируется гиперболой, что характерно для ферментативной кинетики (рис. 2) .

Для определения эффективности биосенсора используют количественную характеристику – чувствительность. Коэффициент чувствительности находили как первую производную к гиперболической зависимости, и при низких значения БПК он составил (48,0±0,1)•10-3 мин-1, что на порядок выше, чем при использовании другого метода иммобилизации, включении в гель поливинилового спирта [1], а также Известия ТулГУ. Естественные науки. 2016. Вып. 4 более стабильным, в сравнении с биосенсором другого поколения – медиаторным биосенсором [18] .

Скорость изменения содержания кислорода, мгО2 /дм *сек 0,0024 0,0022 0,0020 0,0018

–  –  –

Рис.2. Графические зависимости ответа сенсора от БПК для полученного гетерогенного биокатализатора при использовании в качестве субстрата ГГС Таким образом, клетки дрожжей D. hansenii, покрытые органосиликатной оболочкой, могут стать основой БПК-биосенсора, характеризующегося повышенной чувствительностью и стабильностью .

С целью апробации и коррелятивной оценки БПК-биосенсора были взяты образцы воды из источников Тульской области. Пробы представляли собой образцы речной и колодезной воды. Отбор проб производился в соответствии со стандартной методикой [19]. Определение БПК5 стоков стандартным методом разбавления проводилось согласно действующим нормативным документам [19, 20]. Полученные результаты представлены в таблице .

Статистический анализ результатов определения БПК показал, что выборки, полученные двумя методами, однородны по воспроизводимости .

Значения БПК, определяемые с помощью биосенсора на основе инкапсулированных дрожжей и стандартным методом, незначимо отличаются между собой .

–  –  –

Заключение В ходе работы дрожжи Debaryomyces hansenii ВКМ Y-2482 были иммобилизованы в кремнийорганическую золь-гель матрицы. Получен стабильный рецепторный элемент биосенсора с высокой чувсвительностью. Показано, что с помощью разработанного БПК-биосенсора возможно определять значения БПК сточных вод. Значения БПК, определяемые с помощью разработанного биосенсора и стандартным методом, незначимо отличаются между собой. Таким образом, БПК-биосенсор на основе инкапсулированных дрожжей Debaryomyces hansenii в золь-гель матрицу является перспективным инструментом для мониторинга загрязнений сточных вод .

Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта № 16-38-00700 мол_а и Правительства Тульской области (ДС/50) .

Библиографический список

1. BOD biosensor based on the yeast Debaryomyces hansenii immobilized in poly(vinyl alcohol) modified by N-vinylpyrrolidone / V.A .

Arlyapov, N.Y. Yudina, L.D. Asulyan [et al.]// Enzyme Microb. Technol. 2013 .

V. 53. № 4. P. 257–262 .

2. Methods for assessing biochemical oxygen demand ( BOD ): A review / S. Jouanneau, L. Recoules, M.J. Durand [et al.] // Water Res. Elsevier Ltd, 2013. V. 49. P. 62–82 .

3. Chouler J., Lorenzo M. Di. Water Quality Monitoring in Developing Countries; Can Microbial Fuel Cells be the Answer. 2015. P. 450–470 .

4. Влияние времени культивирования, состава исследуемых проб и условий анализа на окислительную активность дрожжей / Н.Ю. Юдина, В.А. Арляпов, А.С. Зайцева [и др.]// Известия ТулГУ. Естественные науки .

2012. №3. C. 186–197 .

5. Living bacteria in silica gels / N. Nassif, O. Bouvet, N.M. Rager [et al.] // Nat Mater. 2002. P. 42-44 .

Известия ТулГУ. Естественные науки. 2016. Вып. 4

6. Sakai-Kato K., Ishikura K. Integration of biomolecules into analytical systems by means of silica sol-gel technology // National Institute of Health Science. 2005. V. 6. P. 70-75 .

7. Artificial Spores: Cytocompatible Encapsulation of Individual Living Cells within Thin, Tough Artificial Shells / S.H. Yang, D. Hong, J. Lee [et al.] // Small. 2013. V. 9. № 2. P. 178-186 .

8. Fabrication and characterization of dodecylamine derived monodispersed mesoporous bioactive glass sub-micron spheres / Q. Hu, X .

Chen, N. Zhao [et al.] // Journal of Sol-Gel Science and Technology .

2013.10.1007/s10971-013-3167-6. P. 1-8 .

9. Dickson D. J., Ely R. L. Silica sol-gel encapsulation of cyanobacteria:

lessons for academic and applied research // Appl Microbiol Biotechnol. 2013 .

V. 97/ I. 5. P. 1809-19 .

10. Co-immobilized microbial biosensor for BOD estimation based on sol–gel derived composite material / J. Jia, M. Tang, X. Chen [et al.] // Biosensors and Bioelectronics. 2003. V. 18/ I. 8. P. 1023-1029 .

11. Yeast-based self-organized hybrid bio-silica sol–gels for the design of biosensors / O.N. Ponamoreva, O.A. Kamanina, V.A. Alferov [et al.] // Biosens. Bioelectron. 2015. V. 67. P. 321–326 .

12. Biosensor analyzer for {BOD} index express control on the basis of the yeast microorganisms Candida maltosa, Candida blankii, and Debaryomyces hansenii / V. Arlyapov, S. Kamanin, O. Ponamoreva [et al.] // Enzyme and microbial technology. 2012. V. 50. №. 4. P. 215-220 .

13. BOD biosensor based on the yeast Debaryomyces hansenii immobilized in poly(vinyl alcohol) modified by N-vinylpyrrolidone / V. A .

Arlyapov, N.Yu. Yudina, L.D. Asulyan [et al.] // Enzyme and microbial technology. 2013. V. 53. №. 4. P. 257-262 .

14. PereiraM. F. O. S. A Portrait of State-of-the-art Research at the Technical University of Lisbon / ed. Pereira M. F. O. S.: Springer, 2007. 621 p .

15. Breuer U., Harms H. Debaryomyces hansenii an extremophilic yeast with biotechnological potential // Yeast. 2006. V. 23. № 6. P. 415–437 .

16. Ratledge C.T.K.-H. In Yeast Biotechnology and Biocatalysis. Marcel Dek. New York, 1990. 253 p .

17. Determination of BOD-values of starch-containing waste water by a BOD- biosensor / M. Reiss, A. Heibges, J. Metzger [et al.] // Biosens .

Bioelectron. 1998. Vol. 13, № 10. P. 1083–1090 .

18.. Медиаторный биосенсор на основе дрожжевых клеток Debaryomyces hansenii для определения БПК / Е.Е. Бабкина, В.А. Арляпов, А.В. Беленьких [и др.] // Известия Тульского государственного университета. Естественные науки. 2011. T. 3. C. 199–209

19. ISO 5815-1:2003, 2003. Water Quality-Determination of Biochemical Oxygen Demand after NDays (BODn) - Part 1: Dilutionand Seeding Method with Allylthiourea Addition .

Химические науки

20. ПНД Ф 14. 1:2:3:4. 123-97. Количественный химический анализ вод. Методика выполнения измерений биохимической потребности в кислороде после n-дней инкубации (БПКполн) в поверхностных пресных, подземных (грунтовых), питьевых, сточных и очищенных сточных водах .

М.: 1997. 25 с .

21. Electrochemical biosensors: recommended definitions and classification / D. R. Thevenot, K. Toth, R.A. Durst [et al.] // Biosens .

Bioelectron. 2001. V. 16. P. 121–131 .

Афонина Елена Леонидовна, магистрант, still_elive@mail.ru, Россия, Тула, Тульский государственный университет Лаврова Дарья Геннадьевна, аспирант, d.g.fedoseeva@gmail.com, Россия, Тула, Тульский государственный университет Щукина Ксения Сергеевна магистрант, shukina.xenya@yandex.ru, Россия, Тула, Тульский государственный университет Каманина Ольга Александровна, канд. хим. наук, ассист., o.a.kamanina@gmail.com, Россия, Тула, Тульский государственный университет

BOD-BIOSENSOR BASED ON THE YEAST DEBARYOMYCES HANSENII

IMMOBILIZED IN SOL-GEL MATRIX

E.L. Afonina, D.G. Lavrova, K.S. Shukina, O.A. Kamanina Organosilicate materials based on tetraethoxysilane (TEOS), methyltriethoxysilane (MTES) and polyethylene glycol (PEG) with a molecular weight of 3000 Da were synthesized .

Silane precursors TEOS and MTES (ratio of 15/85) and PEG 3000 were used for immobilization of yeast Debaryomyces hansenii VKM Y-2482 in the silicone sol-gel matrix. Previously, it was shown that capsules are formed around each cell and protect them from harmful environmental factors. Encapsulated microorganisms were used to develop a BOD- biosensor .

BOD values determined using biosensor-based encapsulation of yeast and standard method differ insignificantly. The developed biosensor is a promising tool for monitoring waste water pollution degree .

Key words: BOD-biosensor, biochemical oxygen demand, sol-gel, encapsulated microorganisms, hybrid materials Afonina Elena Leonidovna, undergraduate, still_elive@mail.ru, Russia, Tula, Tula State University, Lavrova Daria Gennadievna, postgraduate student, d.g.fedoseeva@gmail.com, Russia, Tula, Tula State University, Shukina Kseniya Sergeevna, undergraduate, shukina.xenya@yandex.ru, Russia, Tula, Tula State University, Kamanina Olga Aleksandrovna, candidate of chemical sciences, assistant professor,




Похожие работы:

«Научный журнал КубГАУ, №75(01), 2012 года 1 УДК 664.7:631.363.28:621.979.2 UDC 664.7:631.363.28:621.979.2 MATHEMATICAL MODELING OF WORKING МАТЕМАТИЧЕСКОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ PROCESS IN ROLLER-DIE PELLET MILL РАБОЧЕГО ПРОЦ...»

«Булина Наталья Васильевна ИССЛЕДОВАНИЕ НАНОМАТЕРИАЛОВ, ПОЛУЧЕННЫХ В РЕЗУЛЬТАТЕ КОНДЕНСАЦИИ ИОНИЗИРОВАННОГО УГЛЕРОДНОГО ПАРА, СОДЕРЖАЩЕГО ДОПИРУЮЩИЕ ВЕЩЕСТВА, ПРИ АТМОСФЕРНОМ ДАВЛЕНИИ Специальность 01.04.0...»

«А. А. С а м а р с к и й ВВЕДЕНИЕ В ТЕО РИ Ю РАЗНОСТНЫ Х СХЕМ Главная редакция физико-математической литературы изд-ва "Наука", М., 1971. В книге излагаю тся соврем енны е м етоды разностного р еш ен ия задач м а т е м а т и ч е с к о й ф и з и к и и о т н...»

«Ж ЕРО Олег Генрихович УДК 553.98(571.1) ТЕКТОНИКА ДОЮРСКОГО Ф В А Л Н А ЗАПАДНО-СИБИРСКОЙ УДГЕТ ПЛИТЫ В СВЯЗИ С НЕФТЕГАЗОНОСНОСТЬЮ ПАЛЕОЗОЯ И ТРИАС-ЮРСКИХ ОТЛОЖЕНИЙ Специальность 04.00.17 геология, поиски и разведка не^)тяных и газовых месторождений Дисс...»

«УДК 81' 342.1+81' 342.2 В. Б. Кузнецов канд. филол. наук, проф. каф. прикладной и экспериментальной лингвистики Института прикладной и математической лингвистики МГЛУ; e-mail: kuvlad2007@yandex.ru МЕТОД ЛИНЕЙНОГО ПРЕДИКТИВНОГО КОДИРОВАНИЯ (ЛПК) В ФОНЕТИЧЕСКИХ...»

«ВАЦАДЗЕ Сергей Зурабович (05 апреля 1967) Доктор химических наук, профессор Профессор МГУ имени М.В.Ломоносова, химический факультет, кафедра органической химии, лаборатория супрамолекулярной химии и нанотехнологии органических материалов. Зам. зав. кафедрой (с 2014). Ученый секретарь Научно-образовательного центра по сверхкри...»

«М.К. Болога, Т.Г. Степурина, А.М. Болога, А.A. Поликарпов, Е.Г. Спринчан ОПТИМИЗАЦИЯ ИЗОМЕРИЗАЦИИ ЛАКТОЗЫ В ЛАКТУЛОЗУ ЭЛЕКТРОФИЗИЧЕСКИМ МЕТОДОМ Институт прикладной физики АН Молдовы, ул. Академией, 5, г. Кишинев, MD-2028, Республика Молдова, mbologa@phys.asm.md В настоящее время лактулоза самый эффективный пребиотик, широко используем...»

«Newtons4th Ltd office@n4l.ru; office@newtons4th.com www.n4l.ru; www.newtons4th.com ПРИМЕРЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ – 030 ДПФ или БПФ? Сравнение методов преобразований Фурье В документе рассматривается различие в производительности методов ДПФ (дискретное преобразование Фурье)...»








 
2018 www.new.z-pdf.ru - «Библиотека бесплатных материалов - онлайн ресурсы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 2-3 рабочих дней удалим его.